來自ATCC的細胞培養指南（精簡版）

每天對待細胞那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丟了。如果手里有一份來自機構ATCC的《細胞培養指南》，養細胞可就得心應手多了。下面是細胞培養指南（精簡版），值得收藏。

   綜述

細胞要么在培養瓶表面貼壁生長（錨定依賴性）要么懸浮生長（非錨定依賴性）。細胞的生長和分裂，通常遵循一個由四個階段組成的特征性增長模式：停滯期，對數期（指數期），平穩期（平臺期）和衰退期。

停滯期——將細胞接種至培養瓶之后，細胞逐步恢復的同時，緩慢生長。

對數期（指數期）——細胞進入一個對數生長的時期，一直持續到整個生長表面被占滿或細胞密度超過培養基提供營養的能力。

平穩期——細胞增殖減慢或停止。

衰退期——如果不更換培養基且細胞數量不減少，細胞活力會下降，并出現細胞死亡。

為了確?；盍?，遺傳穩定性和表型穩定，必須使細胞保持在對數期。這意味著細胞需要在進入平穩增長階段之前，或在單層細胞長成100%融合之前，或在懸浮細胞達到推薦的最大細胞密度之前定期進行傳代培養。為每個細胞系繪制生長曲線，對于測定該細胞系的生長特性是必要的。

~凍存細胞復蘇~

培養一個新的細胞時要特別注意培養基一致性的問題。雖然大多數細胞系可以在不止一種培養基中生長，但是當培養基改變時，細胞的性質也會變化。來自于不同廠家的培養基，即使名字相同或類似，配方也略有差異。仔細閱讀說明書，配方，標簽，確保使用正確的培養基。

細胞復蘇時，應以最快速度融化凍存的細胞溶液，然后迅速與*培養基混合，并接種到合適的細胞瓶中。

復蘇程序

1) 準備細胞培養容器（如T-75細胞瓶），加入至少10 ml適當的培養基，并平衡溫度及pH。

2) 從液氮罐中取出凍存管，并在37℃（或適合該細胞的溫度）水浴中緩慢搖動至冰晶*融化（約2 min），注意解凍過程要迅速。

3) 從水浴中取出凍存管，浸泡或者噴撒酒精消毒。后續的操作，需在無菌操作臺中，并保證嚴格無菌。

4) 擰開凍存管蓋，將細胞懸液轉移至含有9ml*培養基的無菌離心管中。溫和離心(125g×10min)，棄去上清去除凍存保護劑。注意不要擾動細胞層。加入1-2 ml*培養基重懸細胞，緩慢吹打使細胞團變松散。將細胞懸液轉移至含培養基的容器中充分混合。

5) 24小時后，檢測細胞狀態。

細胞傳代培養~

單層貼壁細胞的傳代培養

為了保證單層貼壁細胞的對數生長，需要定期傳代。當細胞生長接近指數生長后期(匯合率大約70%到90%)，準備傳代。針對傳代過程，ATCC提供的產品說明中，會推薦細胞傳代分配比例和補充培養基策略。

單層貼壁細胞傳代，需要打斷細胞之間的連接。對于比較松散的連接，猛擊培養瓶側壁，可以分離細胞。很多情況下，需要/EDTA的蛋白水解酶來消化。對于一些細胞系，需要采用刮等機械方法分離細胞。細胞分離成為單細胞懸液后，稀釋到適當的密度并轉移到新的培養瓶中，在適當的生長培養基中，細胞將再貼壁生長和分裂。

由于每種細胞都是的，孵化時間和溫度、清洗次數或溶液配方可能會有所不同。分離過程中，應用顯微鏡密切觀察細胞，以防止細胞損傷。這個過程根據容器使用合適的培養體積。

懸浮細胞的傳代培養

相對于單層貼壁細胞來說，懸浮細胞的傳代更具有優勢，單層貼壁細胞需要蛋白水解酶，會造成細胞損傷。而懸浮細胞可以使用稀釋的方法來傳代，細胞生長沒有延遲，對實驗室空間要求較小，傳代培養是線性放大的。比如細胞可以在發酵罐中培養。

根據細胞類型，懸浮培養接種密度從2×10*4至5×10*5活細胞/ml。收獲時細胞密度2×10*6細胞/ml。如果細胞接種密度過低，他們將經歷增長延遲階段，增長非常緩慢甚至*死亡。如果細胞密度過高，細胞可能耗盡培養基中營養，而突

~細胞凍存~

隨著細胞被冷凍至冰點以下，懸液中冰晶和溶質的濃度有所增加。如果冷卻過程中，胞內水分可以滲出細胞，則可以減少胞內冰晶。通常1℃/min的降溫速度可以促進此過程。但是，水分的喪失會導致細胞收縮，當這種收縮達到一定程度，又會導致細胞活性的劇烈下降。冷凍保護劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO），可以緩解這種效應。細胞凍存的標準程序是在含有冷凍保護劑的培養基中，將細胞緩慢冷凍至–70℃，然后將凍存管轉移到液氮中以保持低于–130℃的環境。

有很多方法可以實現1℃/min的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統是好的方式，可以精確保持降溫速度。這也是ATCC采用的方法。但這種設備價格較高。比較經濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于–70℃的冰箱中凍存24小時。之后再轉移至液氮長期儲存。

以下程序適用于大多數細胞。凍存培養基的配方請參考細胞說明書。凍存時，細胞應處于指數生長期。

凍存程序

1) 凍存前先檢測細胞是否受到細菌、真菌、支原體和病毒的污染。如果確定有污染，應將該細胞銷毀。

2) 凍存培養基由*培養基和5%D